Adesea folosită ca metodă rapidă pentru indicarea și identificarea virușilor.

Această metodă a fost dezvoltată pentru prima dată de K. Mullis (SUA) în 1983. Datorită sensibilității sale ridicate, specificității și ușurinței de implementare, este utilizată pe scară largă în genetică, medicină legală, diagnosticare și alte domenii.

Esența metodei este amplificarea, adică creșterea numărului de copii ale fragmentelor strict definite ale unei molecule de ADN in vitro. Această metodă utilizează un mecanism matriceal și principiul complementarității. Două lanțuri polinucleotidice simple (acizi nucleici) pot fi legate prin legături de hidrogen într-un lanț dublu catenar dacă secvențele de nucleotide ale unuia se potrivesc exact cu secvența de nucleotide ale celuilalt, astfel încât bazele lor azotate să poată forma adenin-timină și guanină-citozină. perechi.

PCR se bazează pe amplificarea ADN-ului folosind o ADN polimerază termostabilă, care sintetizează catene de ADN complementare reciproc, începând cu doi primeri. Un primer este un fragment de ADN format din 20-30 de nucleotide. Acești primeri sunt complementari catenelor de ADN opuse. În timpul sintezei ADN, primerii sunt inserați în lanțul de molecule de ADN nou sintetizate.

De obicei, PCR se efectuează în 25-40 de cicluri. Fiecare ciclu include trei etape: prima este denaturarea la 92-95 °C. În acest caz, cele două catene de ADN diverg; al doilea este recoacere sau adăugare de primeri la 50-65 ° C; a treia este alungirea sau polimerizarea la 68-72 ° C, în timp ce ADN polimeraza realizează completarea complementară a lanțurilor șablon ADN folosind patru tipuri de nucleotide. Ca rezultat al unui ciclu, materialul genetic dorit este dublat. Lanțurile de ADN formate în primul ciclu servesc ca șabloane pentru al doilea ciclu etc. După primul ciclu, doar fragmentul dintre cei doi primeri este amplificat. Astfel, numărul de copii ale regiunii amplificate este dublat, ceea ce face posibilă sintetizarea a milioane (2 n) de fragmente de ADN în 25-40 de cicluri - o cantitate suficientă pentru indicarea lor prin diverse metode (metoda sondelor de hibridizare care conțin o anumită etichetă, electroforeză etc.) . Mai des, electroforeza pe gel de agaroză cu colorare cu bromură de etidio este utilizată în acest scop.

În PCR din secțiunile de ADN ale unui agent patogen, se folosesc primeri care au o secvență unică de nucleotide caracteristică doar unui anumit agent patogen.

Procedura de realizare a PCR se rezumă la următoarele: o matrice ADN este izolată de materialul studiat; într-o eprubetă, ADN-ul izolat este combinat cu un amestec de amplificare, care include ADN polimeraza, toate cele 4 tipuri de nucleotide, 2 tipuri de primeri, MgCl, tampon, apă deionizată și ulei mineral. Apoi tuburile sunt plasate într-un ciclor, iar amplificarea se realizează automat conform unui program dat corespunzător tipului de agent patogen. Rezultatele sunt înregistrate mai des prin electroforeză într-un gel de agaroză 1-2% în prezența bromurii de etidio, care se combină cu fragmente de ADN și se dezvăluie sub formă de benzi luminoase atunci când gelul este iradiat cu raze UV ​​pe un transiluminator. Toate procedurile PCR durează 1-2 zile lucrătoare.

Pentru a crește specificitatea și sensibilitatea PCR se folosesc diverse opțiuni: PCR imbricată; PCR cu „pornire la cald” folosind un strat de parafină sau blocând centrii activi ai polimerazei cu anticorpi monoclonali. În plus, unele companii produc truse de reactivi liofilizați pentru amplificarea ADN-ului, care accelerează procesul PCR și reduc posibilitatea unor rezultate fals pozitive.

O nouă tehnologie, Real-Time PCR, este în prezent introdusă. Caracteristica sa fundamentală este monitorizarea și analiza cantitativă a acumulării de produse polimeraze reacţie în lanţși înregistrarea și interpretarea automată a rezultatelor obținute. Această metodă nu necesită o etapă de electroforeză, ceea ce reduce cerințele de laborator pentru PCR. PCR în timp real folosește sonde de oligonucleotide marcate fluorescent pentru a detecta ADN-ul pe măsură ce este amplificat. PCR în timp real permite analiza completă a unei probe în 20-60 de minute și este, teoretic, o modalitate de a detecta chiar și o moleculă de ADN sau ARN într-o probă.

Sistemul de detectare a produsului în reacția în lanț a polimerazei în timp real (monitorizare PCR) vă permite să monitorizați acumularea de ADN amplificat ciclu cu ciclu. Sistemul include, de asemenea, o sondă de oligonucleotidă care este capabilă să se atașeze (hibridizarea) la segmentul intern al ADN-ului țintă. Sonda este marcată la capătul 5′ cu un colorant reporter fluorescent, iar la capătul 3′ cu un colorant blocant (colorant de stingere). Pe măsură ce produsul PCR se acumulează, sonda se hibridizează cu acesta, dar nu apare nicio luminiscență datorită apropierii dintre raportor și blocant. Ca rezultat al copierii secvenței, polimeraza ajunge la capătul 5′ al sondei. Activitatea exonucleazei 5’-3’ a polimerazei detașează eticheta fluorescentă de la capătul 3’ al sondei, eliberând astfel reporterul fluorescent de conexiunea sa cu blocantul de semnal, ceea ce duce la o creștere a fluorescenței. Nivelul de fluorescență este astfel proporțional cu cantitatea de produs de reacție specific. Este important ca rezultatele PCR să fie înregistrate prin prezența fluorescenței în tuburi închise și, astfel, se rezolvă o altă dintre principalele probleme ale acestei metode - problema contaminării cu ampliconi.

Avantajele PCR: viteza de analiză; sensibilitate și specificitate ridicate; cantitatea minimă de material de testat; simplitatea executiei si posibilitatea de automatizare completa.

Datorită faptului că sensibilitatea PCR poate ajunge până la detectarea unei copii a matriței ADN, există un grad ridicat de pericol de a obține rezultate fals pozitive. Prin urmare, atunci când efectuează testarea PCR, un laborator de diagnostic genetic trebuie să respecte cu strictețe cerințele speciale pentru aspect și modul de funcționare.

PCR este una dintre metodele complementare existente în diagnosticul virologic. Această reacție este foarte importantă pentru diagnosticul infecțiilor virale atunci când antigenele virale sau anticorpii specifici virusului nu pot fi detectați și când prezența acidului nucleic viral poate fi singura dovadă de infecție, mai ales în infecțiile latente și mixte.

Dacă găsiți o eroare, evidențiați o bucată de text și faceți clic Ctrl+Enter.

Pentru a identifica rapid și precis prezența bolilor genetice și a altor boli la o persoană, medicii folosesc astăzi diagnosticul PCR. Această analiză este foarte informativă și este utilizată pe scară largă de specialiști din diverse domenii. Acest studiu poate arăta prezența bolii cu mult înainte de apariția simptomelor. Astăzi, fără această analiză, medicii nu pun un diagnostic final.

Esența metodei

Metoda a fost descoperită în 1983 de un om de știință american pe nume Kary Mullis. Ulterior, omul de știință a primit Premiul Nobel pentru invenția sa. Ce este un test PCR? Principiul metodei este că, în laborator, specialiștii măresc în mod repetat numărul fragmentelor de ADN uman.

În același timp, molecula de infecție crește. Astfel, celulele străine devin vizibile la microscop. Astăzi se utilizează metoda PCR în zone diferite

. El îi ajută pe criminologi să identifice materialul biologic, să stabilească paternitatea sau maternitatea în litigiu, ajută la identificarea bolilor genetice și indică prezența sau absența bolilor infecțioase.

Ce poate detecta analiza

Tehnicile PCR sunt acum utilizate în mod activ pentru a detecta infecțiile ascunse. Datorită tehnologiei speciale de analiză, infecția poate fi detectată în cele mai incipiente etape, atunci când simptomele nu sunt încă excluse.

• Un test PCR poate arăta prezența următoarelor boli:
• Boli oncologice.
• Hepatită de toate tipurile și subtipurile.
• Ureaplasmoza.
• Salmoneloza.
• Candidoza.
• Difterie.
• Chlamydia.
• Citomegalovirus.
• Micoplasmoza.
• Helicobacterioza.
• Herpes.

Gonoreea etc.

Diagnosticul PCR al infecțiilor este de o importanță deosebită pentru identificarea infecțiilor cronice, lente și latente care nu se manifestă prin simptome specifice. Un astfel de studiu este adesea prescris atunci când planificați sarcina. Este important să examinăm sângele nu numai al viitoarei mame, ci și al tatălui, deoarece multe boli pot fi moștenite.

Beneficiile analizei

• Analiza PCR are o serie de avantaje incontestabile față de alte tipuri de teste de sânge pentru prezența infecțiilor, și anume:
• Detectarea agentului cauzal al bolii cu mare precizie.
• Eliminarea rezultatelor fals pozitive.
• Posibilitatea de a detecta chiar și o singură cușcă de agent patogen.
• Capacitatea de a examina materialul biologic pentru a detecta mai multe infecții simultan.
• Primiți rapid rezultatele cercetării.

Astăzi metoda este îmbunătățită în mod constant. Apar noi teste pentru a detecta viruși și infecții periculoase. Potrivit statisticilor, această examinare este cea care vă permite să detectați celulele dăunătoare cu mult înainte ca acestea să apară. simptome clinice. Aceasta înseamnă că analiza se referă la metode de diagnostic precoce, ceea ce permite pacientului să fie tratat în stadiile incipiente ale bolii.

Astăzi, medicii acordă o importanță deosebită acestei metode în detectarea celulelor canceroase din organism.

Medicii moderni spun că utilizarea PCR cu reacție în lanț a polimerazei în lupta împotriva cancerului este cea mai modernă și eficientă metodă de diagnosticare a oncologiei în stadiile incipiente ale bolii.

Tipuri de analiză

Astăzi, medicii sugerează adesea efectuarea unui test PCR complet. Acest studiu este mai informativ și îi ajută pe medici să stabilească rapid un diagnostic precis. O analiză pentru un anumit agent patogen este efectuată cel mai adesea pentru a monitoriza tratamentul sau atunci când se suspectează o anumită boală, iar un test complex ajută la identificarea infectii ascunse.

Cele mai frecvente studii cuprinzătoare sunt PCR 6 și PCR 12. Numerele din nume indică numărul de infecții pentru care este testat materialul biologic. PCR poate fi, de asemenea, cantitativă sau calitativă. Primul este cel mai adesea mai scump, deoarece determină cu exactitate numărul de celule virale din materialul biologic, ceea ce înseamnă că ajută la stabilirea stadiului bolii.

Cel mai adesea, o analiză este prescrisă atunci când medicii nu pot identifica agentul cauzal al bolii. Deci, de exemplu, un pacient are anumite simptome ale unei boli, dar alte teste nu dezvăluie o infecție. În acest caz, metoda PCR este pur și simplu de neînlocuit. De asemenea, este necesară cercetarea înainte de a planifica o sarcină. În plus, un test de sânge este prescris pentru a detecta bolile genetice congenitale și conform indicațiilor altor medic. În plus, se poate dispune prin hotărâre judecătorească un studiu pentru a determina paternitatea sau alți indicatori la cererea parchetului.

Material pentru cercetare

Diverse fluide și medii umane pot servi drept material pentru cercetare folosind diagnosticarea PCR. Cel mai adesea, sângele pacientului, urina, răzuirea și mucusul sunt luate pentru cercetare. Colectarea acestui sau aceluia material depinde direct de studiul pentru anumite infecții.

Bolile sexuale sunt determinate de frotiuri prelevate din organele genitale, urină sau răzuire. Pentru a determina prezența HIV, hepatită, toxoplasmoză și alte infecții, medicii trebuie să examineze sângele pacientului. Uneori, lichidul cefalorahidian este luat pentru analiză, de exemplu, pentru a-l examina pentru infecții ale sistemului nervos. Și pentru a detecta infecțiile intrauterine, este necesar să se preleveze mostre de lichid amniotic și țesut placentar.

Astăzi, medicii ginecologi sfătuiesc toate femeile să facă un test PCR chiar la începutul sarcinii, dacă nu ați făcut testul în etapa de planificare.

Acest test trebuie efectuat înainte de 12 săptămâni de sarcină. Materialul pentru studiu este luat din colul uterin. Procedura este sigură și nu provoacă disconfort. Analiza ne permite să identificăm infecțiile periculoase care pot afecta dezvoltarea intrauterină a fătului. Această analiză se numește PCR-6.

Reguli de depunere și decodare

Fiecare pacient trebuie să știe că acuratețea rezultatului oricărei analize depinde de respectarea regulilor de depunere a biomaterialului. Metoda și regulile pentru efectuarea analizei sunt determinate de tipul testului. Dacă trebuie să donați sânge, trebuie să veniți dimineața la colectare pe stomacul gol. Dacă este necesară testarea infecțiilor cu transmitere sexuală, ar trebui să respectați odihna sexuală cel puțin o zi înainte de a colecta materialul. De asemenea, colectarea urinei necesită respectarea anumitor reguli. Urina trebuie colectată în timpul primei urinare dimineața. Trebuie să colectați urină medie, înainte de a face acest lucru trebuie să spălați și să uscați cu un prosop curat. Recipientul trebuie să fie steril.

Descifrarea rezultatelor cercetării nu este deosebit de dificilă. În diagnosticarea ADN-ului molecular ARN folosind metoda PCR, rezultatul poate fi doar pozitiv sau negativ. Pe formularul de laborator, vizavi de fiecare infecție pentru care a fost efectuat un studiu, puteți vedea un semn „+” sau „-”. În consecință, „+” este un rezultat pozitiv, ceea ce indică faptul că au fost găsite urme ale acestei infecții în materialul studiat.

La descifrarea analizei, este foarte important să se determine raportul cantitativ al celulelor virusului. Prezența unei infecții nu poate fi întotdeauna considerată o boală. Există așa ceva ca să fii purtător al unei infecții. Aceasta înseamnă că o persoană are celule de infecție, dar nu suferă de această boală. Cu toate acestea, un astfel de transport nu protejează împotriva posibilității de a infecta alte persoane. Este analiza cantitativă care îi ajută pe medici să stabilească dacă sunteți purtător sau pacient, precum și să identifice stadiul bolii și să aleagă o terapie eficientă.

Unde se depune

Mulți pacienți sunt interesați de unde să facă un test PCR pentru a obține un rezultat fiabil? Astăzi te poți testa în orice clinică specializată sau centru medical privat. Analiza PCR se plătește, prețul acesteia depinde de tipul testului.

Această cercetare nu se desfășoară în clinicile raionale, pur și simplu nu există un echipament modern special;

Mulți oameni neglijează analiza, crezând că nu au nevoie de această cercetare. Cu toate acestea, dacă medicul dumneavoastră v-a prescris această analiză Aceasta înseamnă că a avut anumite dificultăți în a face un diagnostic precis și, prin urmare, în a prescrie o terapie eficientă. În acest caz, este mai bine să treceți la studiu, deoarece este în interesul dumneavoastră.

De asemenea, toate cuplurile tinere care plănuiesc o sarcină trebuie să fie supuse acestei examinări. O recomandare pentru testare poate fi obținută de la un centru de planificare familială. De asemenea, multe cupluri nu acordă importanța cuvenită analizei, crezând că dacă soții nu au boli ereditare evidente, atunci copilul lor se va naște sănătos. Cu toate acestea, astăzi există o mulțime de infecții ascunse care pot afecta cursul sarcinii și sănătatea bebelușului.

Astăzi, metodele de diagnostic pot dezvălui cele mai ascunse infecții care pot trăi în corpul uman ani de zile fără a se manifesta. Cu toate acestea, nu trebuie să faceți singur testele. Toate studiile trebuie efectuate conform indicațiilor medicului curant, altfel viața ta se poate transforma în călătorii nesfârșite la centrele de diagnostic. În primul rând, dacă aveți vreo plângere, ar trebui să consultați un medic. El va fi cel care va putea să vă evalueze starea și să vă prescrie doar analizele care vă sunt necesare.

GOU VPO „Academia Medicală de Stat Krasnoyarsk”

numit după Agenția Federală pentru Sănătate și Dezvoltare Socială Yasenetsky »

Departamentul de Genetică Medicală și Neurofiziologie Clinică IPO

PRINCIPIILE DE BAZĂ ALE METODEI

REACȚIA LANȚULUI POLIMERAZEI

Manual metodologic pentru elevii de 3-4 ani

în specialităţile de medicină generală (060101) şi

Krasnoyarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Principiile de bază ale metodei reacției în lanț a polimerazei. Manual metodologic de lucru extracurricular al elevilor de 3-4 ani la specialitățile de medicină generală (060101) și pediatrie (060103). – Krasnoyarsk: Editura Instituției de Învățământ de Stat de Învățământ Profesional Superior KrasSMA, 2007. – 42 p.

Manualul didactic respectă pe deplin cerințele Standardului de stat (2000) și reflectă principalele aspecte ale metodei moderne de diagnosticare a bolilor ereditare umane - metoda reacției polimerazei în lanț, materialul educațional este adaptat la tehnologiile educaționale, ținând cont de specificul de pregătire în 3-4 ani de facultăţi de medicină şi pediatrie.

Recenzători:Șef al Departamentului de Genetică Medicală, Instituția de Învățământ de Stat de Învățământ Profesional Superior

„Universitatea Medicală de Stat Novosibirsk a Agenției Federale pentru Sănătate și Dezvoltare Socială”, doctor în științe medicale, profesor;

Replicarea ADN-ului

Obiectul de studiu al acestei metode este acidul dezoxiribonucleic (ADN). ADN-ul este purtătorul universal de informații genetice în toate organismele existente pe Pământ (cu excepția microorganismelor care conțin ARN). ADN-ul este o catenă dublă răsucită într-o spirală. Fiecare catenă constă din nucleotide conectate în secvență. Catenele de ADN au direcții opuse: capătul de 5" al unei catene corespunde capătului de 3" al celei de-a doua catene. O proprietate unică a ADN-ului este capacitatea sa de a se dubla. Acest proces se numește replicare. Replicarea moleculei de ADN are loc în perioada de sinteză a interfazei. Fiecare dintre cele două lanțuri ale moleculei „mamă” servește ca șablon pentru „fiică”. După replicare, molecula de ADN nou sintetizată conține o catenă „mamă”, iar a doua este o catenă „fiică” nou sintetizată (metoda semi-conservativă). Pentru sinteza șablonului unei noi molecule de ADN, este necesar ca vechea moleculă să fie despirată și alungită. Replicarea începe în mai multe locuri din molecula de ADN. Se numește secțiunea unei molecule de ADN de la punctul de început al unei replici până la punctul de început al alteia replicon.

Începutul replicării este activat grunduri(amorsari) formate din 100-200 de perechi de nucleotide. Enzima ADN helicaza se desfășoară și împarte helixul ADN-ului mamă în două catene, pe care, conform principiului complementarității, cu participarea enzimei ADN polimerază, sunt asamblate catenele ADN „fiice”. Pentru ca enzima să își înceapă activitatea, este necesară prezența unui bloc de pornire - un mic fragment inițial dublu catenar. Blocul de pornire este format prin interacțiunea primerului cu regiunea complementară a catenei corespunzătoare a ADN-ului părinte. În fiecare replicon, ADN polimeraza se poate deplasa de-a lungul catenei „mamă” într-o singură direcție (5`=>3`).

Pe firul principal, pe măsură ce repliconul se desfășoară, o șuviță „fiică” crește treptat continuu. Pe șuvița rămasă, șuvița fiică se sintetizează și în direcția (5`=>3`), dar în fragmente separate pe măsură ce repliconul se desfășoară.

Astfel, adăugarea de nucleotide complementare ale catenelor „fiice” are loc în direcții opuse (antiparalel). Replicarea în toate replicon-urile are loc simultan. Fragmentele și părțile catenelor „fiice” sintetizate în diferiți repliconi sunt cusute într-o singură catenă de către enzima ligază. Replicarea se caracterizează prin semi-conservativitate, antiparalelism și discontinuitate. Întregul genom al unei celule este replicat o dată într-o perioadă de timp corespunzătoare unui ciclu mitotic. Ca rezultat al procesului de replicare, dintr-o moleculă de ADN se formează două molecule de ADN, în care o catenă este din molecula de ADN-mamă, iar a doua, fiică, nou sintetizată (Fig. 1).

Orez. 1. Schema de replicare a moleculei de ADN.

Astfel, ciclul de replicare a ADN-ului include trei etape principale:

1. derularea helixului ADN și divergența catenelor (denaturare);

2. atașarea primerilor;

3. completarea lanțului firului copil.

Principiul metodei PCR

Replicarea ADN-ului este cea care formează baza PCR. În PCR, procesele de mai sus sunt efectuate într-o eprubetă într-un mod ciclic. Trecerea de la o etapă de reacție la alta se realizează prin modificarea temperaturii amestecului de incubare. Când soluția este încălzită la 93-95°C, are loc denaturarea ADN-ului. Pentru a trece la următoarea etapă - adăugarea sau „recoacerea” primerilor - amestecul de incubare este răcit la 50-65°C. Apoi, amestecul este încălzit la 70-72°C - optimul pentru taq-ADN polimeraza - în această etapă are loc construcția unei noi catene de ADN. Apoi ciclul se repetă din nou. Cu alte cuvinte metoda PCR este o creștere multiplă a numărului de copii (amplificare) o secțiune specifică de ADN catalizată de enzima ADN polimeraza.

Creșterea catenelor fiice de ADN trebuie să aibă loc simultan pe ambele catene de ADN matern, astfel încât replicarea celei de-a doua catene necesită, de asemenea, propriul său primer. Astfel, la amestecul de reacție se adaugă doi primeri: unul pentru lanțul „+”, al doilea pentru lanțul „-”. Fiind atașați de catenele opuse ale moleculei de ADN, primerii se limitează la partea din acesta care va fi ulterior duplicată sau amplificată de multe ori. Lungimea unui astfel de fragment, numit amplicon, este de obicei de câteva sute de nucleotide.

Etapele PCR

Fiecare ciclu de amplificare include 3 etape, care au loc la diferite conditii de temperatura(Fig. 2).

· Etapa 1: Denaturarea ADN-ului . Apare la 93-95° timp de 30-40 de secunde.

· Etapa 2: recoacere grund . Atașarea primerilor are loc complementar cu secvențele corespunzătoare pe catenele de ADN opuse la granițele unei regiuni specifice. Fiecare pereche de grunduri are propria sa temperatură de recoacere, ale cărei valori sunt în intervalul 50-65°C. Timp de recoacere 20-60 sec.

· Etapa 3: completarea lanțurilor ADN. Completarea complementară a lanțurilor ADN are loc de la capătul de 5" până la capătul de 3" al lanțului în direcții opuse, începând de la locurile de atașare a primerului. Materialul pentru sinteza noilor lanțuri de ADN este trifosfații dezoxiribonucleozidici adăugați în soluție. Procesul de sinteză este catalizat de enzima taq polimeraza și are loc la o temperatură de 70-72°C. Timpul de sinteză este de 20-40 de secunde.

Noile lanțuri de ADN formate în primul ciclu de amplificare servesc ca șabloane pentru cel de-al doilea ciclu de amplificare, în care se formează un fragment de amplicon ADN specific (Fig. 3). În ciclurile de amplificare ulterioare, ampliconii servesc ca șablon pentru sinteza noilor lanțuri.

Astfel, acumularea de ampliconi în soluție are loc conform formulei 2", unde n este numărul de cicluri de amplificare. Prin urmare, chiar dacă soluția inițială conținea inițial o singură moleculă de ADN dublu catenar, atunci în 30-40 de cicluri aproximativ 108 molecule de amplicon se acumulează în soluție. Aceasta cantitate este suficientă pentru detectarea vizuală fiabilă a acestui fragment prin electroforeză pe gel de agaroză.

Procesul de amplificare se realizează într-un termostat programabil special ( termociclor), care, conform unui program dat, schimbă automat temperaturile în funcție de numărul de cicluri de amplificare.

Pentru a realiza amplificarea, sunt necesare următoarele componente:

· matricea ADN-ului(ADN sau o parte a acestuia care conține fragmentul specific dorit);

· Grunduri(oligonucleotide sintetice (20-30 perechi de nucleotide), complementare cu secvențele de ADN la limitele fragmentului specific în curs de determinare). Alegerea unui fragment specific și selecția primerilor joacă un rol critic în specificitatea amplificării, ceea ce afectează calitatea analizei.

· Amestec de trifosfați deoxinucleotidici (dNTPs)(un amestec de patru dNTP, care sunt materialul pentru sinteza noilor lanțuri complementare de ADN în concentrații echivalente de 200-500 µM)

· EnzimăTaq-polimeraza(ADN polimerază termostabilă care catalizează alungirea lanțurilor de primer prin adăugarea secvențială a bazelor nucleotidice la lanțul în creștere al ADN-ului sintetizat, 2-3 mM).

· Soluție tampon(mediu de reacție care conține ioni de Mg2+ necesari menținerii activității enzimatice, pH 6,8-7,8).

Pentru a identifica regiuni specifice ale genomului virusurilor ARN, se obține mai întâi o copie ADN dintr-un șablon de ARN folosind o reacție de transcripție inversă (RT) catalizată de enzima revertază (reverse transcriptază).

Orez. 2. Amplificare (ciclul I).

Orez. 3. Amplificare (ciclul 2).

Principalele aplicații ale PCR

· medicina clinica:

o diagnosticarea infecțiilor,

o identificarea mutațiilor, inclusiv diagnosticul bolilor ereditare,

o genotipare, inclusiv genotipare HLA,

o tehnologii celulare

· ecologie (ca modalitate de a monitoriza starea și calitatea obiectelor de mediu și a produselor alimentare)

· determinarea organismelor transgenice (OMG)

Identificare personală, stabilire a paternității, criminalistică

· biologie generală și specifică,

Principii de bază

organizarea laboratoarelor de diagnostic

Activitatea în laboratorul PCR se desfășoară în conformitate cu „Regulile de proiectare, măsuri de siguranță, salubritate industrială, regim antiepidemic și igienă personală atunci când se lucrează în laboratoarele (departamente, secții) ale instituțiilor sanitare și epidemiologice ale sistemului de sănătate.

Contaminarea probelor de ADN

Efectuarea diagnosticului PCR este asociată cu o problemă din cauza sensibilității ridicate a metodei - posibilitatea contaminare. Introducerea unor urme de ADN pozitiv în tubul de reacție (produse specifice de amplificare a ADN - ampliconi; standard ADN utilizat ca martor pozitiv; ADN pozitiv dintr-o probă clinică) duce la amplificarea unui fragment specific de ADN în timpul PCR și, ca rezultat , la apariția unor rezultate fals pozitive.

În procesul de lucru, puteți întâlni două tipuri de contaminare:

1. contaminare încrucișată de la probă la probă (în timpul prelucrării probelor clinice sau la dizolvarea amestecului de reacție), ducând la rezultate sporadice fals-pozitive;

2. contaminarea cu produse de amplificare(ampliconi), care este de cea mai mare importanță, deoarece în timpul procesului PCR, ampliconii se acumulează în cantități uriașe și sunt produse ideale pentru reamplificare.

Contaminarea articolelor din sticlă, a pipetelor automate și a echipamentelor de laborator, a suprafeței băncilor de laborator sau chiar a suprafeței pielii lucrătorilor din laborator cu urme de ampliconi duce la rezultate sistematice fals pozitive. Determinarea sursei de contaminare poate fi foarte dificilă și necesită o investiție semnificativă de timp și bani. Experiența acumulată până în prezent în laboratoare folosind metoda PCR pentru diagnosticare ne permite să formulăm cerințele de bază pentru organizarea unor astfel de laboratoare și efectuarea analizelor în sine. Respectarea acestor cerințe elimină posibilitatea contaminării și a rezultatelor fals pozitive.

Etapele analizei PCR

Acestea sunt separate geografic prin plasarea lor în încăperi separate (Fig. 4, 5):

· Sala de pre-PCR, unde se prelucrează probele clinice, se izolează ADN-ul, se prepară un amestec de reacție pentru PCR și se efectuează PCR (dacă există condiții, se recomandă, de asemenea, să fie efectuate ultimele două etape într-o încăpere separată suplimentară). În aceste incinte, este interzisă efectuarea tuturor celorlalte tipuri de lucrări cu agenți de testare, a căror diagnosticare PCR se efectuează în acest laborator.

· Camera post-PCR, unde se realizează detectarea produselor de amplificare. În această cameră pot fi utilizate și alte metode de detectare. Este recomandabil să amplasați camera de detectare a produsului de amplificare cât mai departe de încăperile pre-PCR.

Camerele de lucru sunt echipate cu lămpi ultraviolete cu o radiație maximă în regiunea de 260 nm (tip DB-60) la o rată de 2,5 W pe 1 m3. Lămpile sunt amplasate astfel încât suprafețele meselor de lucru, echipamentelor și materialelor cu care operatorul are contact în timpul analizei PCR să fie expuse la iradiere directă. Iradierea se efectuează cu 1 oră înainte de începerea lucrului și în decurs de 1 oră după terminarea lucrării.

Medicii de laborator lucrează în haine speciale de laborator, schimbate la mutarea dintr-o cameră în alta și în mănuși de unică folosință. Hainele din camere diferite sunt prelucrate separat. Diferiți angajați lucrează în diferite etape ale analizei PCR.

Pentru lucru se folosesc seturi separate de dozatoare, plastic și sticlă, echipamente de laborator, halate și mănuși, destinate diferitelor etape de analiză și neportabile dintr-o cameră în alta. Echipamentele, materialele și rechizitele din fiecare cameră sunt marcate corespunzător.

Toate etapele de lucru sunt efectuate numai folosind consumabile de unică folosință: vârfuri pentru pipete automate, eprubete, mănuși etc. Asigurați-vă că schimbați vârfurile când treceți de la probă la probă. Este necesar să folosiți vârfuri cu filtru - o barieră de aerosoli pentru a preveni intrarea micropicăturilor de soluție în pipetă. Tuburile și vârfurile uzate sunt aruncate în recipiente speciale sau recipiente care conțin o soluție dezinfectantă. Probele clinice sunt depozitate separat de reactivi.

Pentru procesarea și curățarea locului de muncă, fiecare cameră este dotată cu tampoane din tifon de bumbac (șervețele), pensete, soluții dezinfectante și inactivante.

Laboratorul de diagnostic PCR exclude lucrările legate de producerea (clonarea) și izolarea plasmidelor recombinante care conțin secvențe ADN sau fragmente de gene ale agenților patogeni care sunt diagnosticați în acest laborator.

Colectarea materialului clinic

Materialul care trebuie testat pentru PCR poate fi răzuirea celulelor epiteliale, sânge, plasmă, ser, lichide pleurale și cefalorahidiane, urină, spută, mucus și alte secreții biologice și biopsii.

Materialul este colectat într-o cameră de tratament cu profilul corespunzător. După colectare, probele trebuie livrate la laboratorul de diagnostic PCR cât mai curând posibil.

Probele trebuie prelevate folosind instrumente sterile, de preferință de unică folosință, numai în tuburi sterile de plastic de unică folosință sau tuburi de sticlă, pre-tratate timp de o oră cu un amestec de crom, spălate temeinic cu apă distilată și calcinate într-un dulap de uscare la o temperatură de 150°C. timp de 1 oră.

Zona de detectare (alt etaj sau altă clădire).

Orez. 4. Dispozitiv de laborator PCR cu detecție prin electroforeză.

Zona de detectare (alt etaj sau altă clădire)

Orez. 5. Dispozitiv de laborator PCR cu detectie fluorescenta (analiza cantitativa).

Orez. 6. Camera de extracție ADN. Este prezentată o cutie de masă cu o lampă germicidă.

Orez. 7. Sala de amplificare.

Orez. 8. Camera de detectare.

Orez. 9. Probe de sânge pentru diagnosticul ADN al bolilor ereditare.

Depozitarea și transportul probelor

Pentru a diagnostica bolile ereditare, probele de sânge sunt depozitate pe formulare speciale de hârtie sau în epindorf (tuburi de plastic) în stare înghețată pentru o perioadă lungă de timp (Fig. 9).

Pentru a diagnostica bolile infecțioase, probele sunt păstrate la temperatura camerei timp de cel mult 2 ore. Dacă este necesară o păstrare mai lungă, probele pot fi plasate într-un frigider la o temperatură de 2-8°C pentru o perioadă de cel mult o zi. Este permisă o păstrare mai lungă (până la 2 săptămâni) congelată într-un congelator la o temperatură de minus 20°C. Nu este permisă înghețarea și decongelarea repetată a probelor.

Dacă laboratorul de diagnosticare PCR și camera de procedură pentru prelevare sunt separate geografic, atunci transportul probelor trebuie efectuat în termos sau recipiente termice, în conformitate cu regulile de depozitare a probelor și regulile de transport al materialelor infecțioase.

Extragerea ADN-ului din probe

S-a răspândit metoda de sorbție în fază solidă, care constă în adăugarea unui agent de liză care conține o soluție de guanidină, sorbția ADN-ului pe un sorbent, spălarea repetată și resorbția ADN-ului cu o soluție tampon. La procesarea serului, plasmei sau sângelui integral, se folosește de obicei metoda de extracție cu fenoli. Metoda implică deproteinizarea cu fenol/cloroform urmată de precipitarea ADN (sau ARN) cu etanol sau izopropanol. Prelucrarea se realizează în tuburi de microcentrifugă Eppendor P cu un volum de 1,5 ml. Timpul de procesare este de 1,5-2 ore (Fig. 10).

Orez. 10. extragerea ADN-ului.

Efectuarea PCR

O anumită cantitate de probă din proba clinică procesată este transferată într-un tub special de microcentrifugă de tip Eppendorf cu un volum de 0,2 sau 0,5 ml. Se adaugă un amestec de amplificare format din apă, tampon PCR, soluție de dNTP, soluție de primer și soluție aceeași eprubetă Taq polimerază (adăugată la amestec în ultimul rând) De obicei, volumul amestecului de reacție este de 25 μl Apoi se adaugă o picătură de ulei mineral pentru a preveni evaporarea amestecului de reacție în timpul procesului de amplificare sunt transferate la un termostat programabil (amplificator), unde amplificarea se realizează automat conform unui program dat (Fig. 11).

Orez. 11. Amplificator " Termociclator ».

Timpul de reacție, în funcție de programul specificat, este de 2-3 ore. În paralel cu probele experimentale, se plasează probe de control: controlul pozitiv include toate componentele reacției, dar în locul materialului probei clinice se adaugă un preparat de ADN martor al genei studiate. Martorul negativ include toate componentele reacției, dar în locul materialului clinic sau preparatului ADN se adaugă o cantitate adecvată de apă deionizată sau un extract care nu conține ADN-ul testat. Controlul negativ este necesar pentru a verifica componentele de reacție pentru absența ADN-ului din cauza contaminării și pentru a exclude rezultatele fals pozitive.

Înregistrarea rezultatelor

Fragmentul de ADN specific amplificat este detectat prin electroforeză pe gel de agaroză în prezența bromurii de etidio. Bromura de etidio formează un compus interstițial stabil cu fragmente de ADN, care apare sub formă de benzi luminoase atunci când gelul este iradiat cu radiații UV cu o lungime de undă de 290-330 nm. În funcție de dimensiunea ampliconilor formați ca urmare a PCR, se folosește un gel cu un conținut de agaroză de 1,5% până la 2,5%. Pentru a prepara un gel de agaroză, topiți un amestec de agaroză, tampon și apă într-un cuptor cu microunde sau într-o baie de apă și adăugați o soluție de bromură de etidio. Amestecul, răcit la 50-60°C, se toarnă în matriță într-un strat de 4-6 mm grosime și, cu ajutorul pieptenilor speciali, se fac în gel buzunare pentru aplicarea probei. Pieptenii sunt instalați în așa fel încât să rămână un strat de 0,5-1 mm de agaroză între fundul godeurilor și baza gelului. După ce gelul se întărește, amplificatorul este aplicat pe buzunare în cantitate de 5-15 μl. Se recomandă efectuarea electroforezei unui amestec de markeri de lungime a fragmentelor de ADN în paralel cu probele de control și experimentale. De obicei, un astfel de amestec conține zece fragmente de ADN cu lungimea de 100, 200, 300, etc. perechi de baze.

Utilizarea unui astfel de test face posibilă verificarea lungimii ampliconilor în probele de control și experimentale. Gelul cu proba aplicată este transferat într-o cameră de electroforeză umplută cu tampon, camera este conectată la o sursă de alimentare și se efectuează separarea electroforetică a produselor de amplificare timp de 30-45 de minute la o intensitate a câmpului electric de 10-15 V/ cm. În acest caz, partea frontală a colorantului inclus în amestecul de reacție trebuie să parcurgă cel puțin 3 cm.

După ce electroforeza este finalizată, gelul este transferat într-un transiluminator de sticlă și vizualizat sub lumină ultravioletă. Pentru documentare, gelul este fotografiat pe film Micrat 300 sau înregistrat folosind un sistem video conectat la un computer.

În primul rând, se evaluează probe de control. O bandă strălucitoare portocalie ar trebui să fie prezentă pe pista electroforetică corespunzătoare controlului pozitiv. Mobilitatea sa electroforetică trebuie să corespundă lungimii ampliconului specificată în instrucțiuni.

În pista electroforetică corespunzătoare controlului negativ, o astfel de bandă ar trebui să fie absentă. Prezența unei astfel de benzi în controlul negativ indică contaminarea - contaminarea reactivilor utilizați cu ADN-ul sau ampliconul de testare. Probele de testare sunt evaluate prin prezența unei benzi în pista corespunzătoare, care este situată la același nivel cu banda din proba de control pozitiv. Intensitatea benzii corespunde cantității de ADN testată în probă, ceea ce permite o evaluare semicantitativă a PCR. De obicei, rezultatele pozitive sunt evaluate pe o scară de patru puncte. Dacă strălucirea benzii din proba de testat este foarte slabă, atunci o astfel de probă trebuie rearanjată (Fig. 12).

Orez. 12. Electroforeza pe gel de agaroză.

Aplicații PCR pentrudiagnosticarea mutațiilor punctiforme și a polimorfismelor genelor

Unul dintre principalele domenii de aplicare a PCR în asistența medicală practică este diagnosticarea mutațiilor punctuale și a polimorfismelor genelor. . Există metode directe și indirecte de diagnosticare ADN. În situațiile în care se cunoaște o genă, afectarea căreia duce la dezvoltarea unei boli ereditare, această afectare poate fi detectată prin metode genetice moleculare. Astfel de metode se numesc directe. Folosind metode directe, sunt detectate nereguli în secvența primară de nucleotide a ADN-ului (mutații și tipurile acestora). Metodele directe se caracterizează prin precizie care atinge aproape 100%.

Cu toate acestea, în practică, aceste metode pot fi utilizate în anumite condiții:

· cu localizare citogenetică cunoscută a genei responsabile de dezvoltarea unei boli ereditare;

· gena bolii trebuie donată și secvența sa de nucleotide trebuie cunoscută.

Scopul diagnosticului direct de ADN este de a identifica alelele mutante.

Astfel, în situațiile în care se știe ce fel de deteriorare a ADN-ului duce la o boală ereditară, fragmentul de ADN care conține afectarea este examinat direct, adică se utilizează metoda de diagnostic direct ADN.

Cu toate acestea, până în prezent, genele multor boli nu au fost cartografiate, organizarea lor exon-intron este necunoscută și multe boli ereditare se caracterizează printr-o eterogenitate genetică pronunțată, care nu permite utilizarea deplină a metodelor directe de diagnosticare ADN. Prin urmare, în cazurile în care localizarea leziunii este necunoscută, se utilizează o altă abordare, legată de studiul vecinătății genei responsabile de boala genică, în combinație cu analiza familiei, adică metode indirecte de diagnostic genetic molecular al se folosesc boli ereditare.

Diferite metode pot fi utilizate pentru a detecta mutațiile punctuale și micile deleții, dar toate se bazează pe metoda PCR. Această reacție vă permite să multiplicați secvența de nucleotide ADN de mai multe ori și apoi să căutați mutații. Metodele de căutare a fragmentelor de ADN purtătoare de mutații se bazează pe o analiză comparativă a secvențelor de nucleotide ADN mutante și normale.

Analiza produselor PCR

în procesul de diagnosticare directă a ADN-ului

Implica studiul caracteristicilor specifice ale regiunii genei amplificate. Astfel, în bolile cauzate de expansiunea repetițiilor trinucleotidelor, produsele de amplificare diferă în lungime (reflectând numărul diferit de tripleți din regiunea genei studiate) și, drept consecință, în viteza lor de mișcare în gel. Datorită acestui fapt, se realizează o separare electroforetică clară a alelelor normale și mutante și definiție precisă fragment alungit patologic, adică diagnosticul ADN al bolii (Fig. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Orez. 14. Diagnosticul ștergerii GAG în genă DYT 1 la pacienții cu distonie independentă de dopa (electroforeză pe gel de poliacrilamidă). Benzile 2,3,6 – bolnavi; pistele 1,4,5 – control. Săgeata subțire indică alela normală, săgeata groasă indică alela mai scurtă mutantă (deleția a trei nucleotide).

Dacă întreaga regiune ADN studiată face parte dintr-o deleție extinsă, atunci amplificarea prin PCR a ADN-ului din această alelă ștearsă nu va fi efectuată din cauza lipsei de situsuri pentru hibridizarea primerului. În acest caz, o deleție homozigotă va fi diagnosticată pe baza absență completă Produs de reacție PCR (sinteza ADN-ului nu este posibilă din ambele copii ale genei). Cu o deleție heterozigotă, este posibil să se detecteze un produs PCR sintetizat dintr-o alelă normală (reținută) totuși, pentru a diagnostica în mod fiabil o astfel de mutație, este necesar să se utilizeze metode de imagistică ADN mai complexe care să permită estimarea dozei PCR-ului final; produs.

Pentru a identifica mutațiile punctuale (cel mai adesea substituții de nucleotide) în anumite situsuri, metoda PCR este utilizată în combinație cu alte metode de analiză genetică moleculară. Dacă locația și natura mutației punctuale presupuse sunt cunoscute cu precizie, atunci pentru detectarea țintită a unei astfel de mutații poate fi utilizată endonucleaze de restricție (enzime de restricție) sunt enzime celulare speciale izolate din diferite tulpini de bacterii.

Aceste enzime recunosc secvențe de nucleotide specifice cu lungimea cuprinsă între patru și zece nucleotide. După aceea, restricția (lat. (tăiere)) a acestor secvențe ca parte a unei molecule de ADN dublu catenar este efectuată. Fiecare enzimă de restricție recunoaște și taie într-un loc fix o secvență de nucleotide specifică strict definită -. site de restricție (site de recunoaștere).

În cazurile în care o mutație punctuală modifică locul de recunoaștere natural pentru o anumită enzimă de restricție, această enzimă nu va putea scinda fragmentul mutant amplificat prin PCR. În unele cazuri, o mutație duce la apariția unui nou loc de recunoaștere pentru o anumită enzimă de restricție care este absentă în mod normal.

În ambele situații, produsele PCR mutante și normale tratate cu enzima de restricție selectată vor produce fragmente de restricție de lungimi diferite, care pot fi ușor detectate prin electroforeză (Fig. 15).

Astfel, dacă este necesar să se detecteze rapid orice mutație punctuală specifică, sarcina este redusă la căutarea enzimei de restricție corespunzătoare, al cărei situs de recunoaștere este localizat la locul secvenței de nucleotide perturbate. Tratamentul produselor PCR cu o astfel de enzimă de restricție va face posibilă diferențierea cu ușurință a alelelor normale și mutante. Analiza de restricție simplifică foarte mult detectarea mutațiilor punctuale cunoscute și este acum utilizată pe scară largă pentru diagnosticul direct ADN al bolilor ereditare.

Etapa finală analiza genetică moleculară a mutațiilor este de a determina secvența de nucleotide a fragmentului de ADN studiat (secvențiere), care este comparată cu norma și se formulează un diagnostic genetic final. Datorită succeselor geneticii moleculare, acum au fost dezvoltate metode de diagnostic ADN pentru mai mult de 400 de boli ereditare.

Orez. 15. Detectarea mutației punctuale folosind analiza de restricție: A – regiune genică amplificată care conține un situs de restricțieAGCTpentru endonuclează de restricţieAlu eu. MutaţieG→ Omodifică această secvență de nucleotide, rezultând enzima de restricțieAluIblocat; B – electroferograma produșilor de restricție: pista 1 – homozigote pentru alela normală; pista 2 – homozgozitate pentru mutație; pista 3 – stare heterozigotă (alelă normală + mutație).

Diagnosticul bolilor ereditare, bazat pe studiul direct al alelelor mutante la pacienți, membrii familiei acestora sau purtători heterozigoți suspectați de mutații patologice, este potrivit pentru diagnosticul pre-simptomatic și prenatal, care poate fi aplicat în primele etape ale dezvoltării fetale, înainte de apariția oricăror simptome clinice sau biochimice boli.

Indiferent de metoda de detectare a mutațiilor, caracteristicile moleculare precise ale fiecărei mutații pot fi obținute numai prin secvențiere directă. Pentru a automatiza acest proces în ultimii ani Sunt utilizate pe scară largă dispozitive speciale - secvențiere, care fac posibilă accelerarea semnificativă a procesului de citire a informațiilor ADN.

Calea către o utilizare mai largă a cercetării biologice moleculare în laboratoarele de diagnostic clinic este deschisă prin accelerarea procesului analitic prin efectuarea tuturor procedurilor într-un continuum, fără transfer de probe, creând condiții pentru prevenirea contaminării în timpul testării paralele a unui număr de analiți și prin înregistrarea obiectivă a rezultate în fiecare ciclu.

Principalele modificări ale metodei PCR

Folosit pentru a scana și a căuta rapid mutații genetice cunoscute.

PCR multiplex (multi-primer).

Această metodă se bazează pe amplificarea simultană a mai multor exoni ai genei studiate într-o singură reacție. Acest lucru permite screening-ul rapid rentabil al celor mai frecvente mutații. De exemplu, pentru a diagnostica rapid purtarea delețiilor în gena distrofinei la pacienții cu distrofie musculară Duchenne/Becker progresivă, se efectuează amplificarea simultană a unui set de exoni cei mai frecvent mutați ai acestei gene. Deoarece aceste boli sunt moștenite într-o manieră recesivă legată de X și sunt asociate cu deteriorarea singurului cromozom X la băieți, în cazul unei deleții extinse, electroforeza produselor de reacție va dezvălui absența unuia sau mai multor fragmente de ADN (exoni). ), care poate servi ca confirmare moleculară a diagnosticului. În plus, prin selectarea secțiunilor specifice de genă pentru amplificarea PCR, este posibilă o evaluare destul de precisă a lungimii totale a deleției și a punctelor de rupere a genei (până la exon).

Utilizarea combinată a mai multor reacții multiple face posibilă diagnosticarea a până la 98% din toate delețiile care apar la pacienții cu distrofie musculară Duchenne/Becker progresivă. Aceasta reprezintă aproximativ 60% din numărul total de mutații cunoscute ale genei distrofinei și indică eficiența foarte mare a acestei metode de screening pentru diagnosticul ADN al distrofinopatiilor (Fig. 16).

Orez. 16. Diagnosticul ADN direct al distrofiei musculare Duchenne folosind PCR multiplex (electroforeza pe gel de agaroză).

La fiecare dintre indivizii examinați, patru exoni ai genei distrofinei au fost amplificați simultan (exonii 17, 19, 44 și 45; săgețile indică produsele de amplificare corespunzătoare). Banda 1 – control, benzile 2-5 – pacienți cu distrofie musculară Duchenne cu diverse deleții ale genei distrofinei (bandele 2 și 5 – ștergerea exonului 45, calea 3 – ștergerea exonului 44, calea 4 – ștergerea exonilor 17 și 19 ).

Metoda se bazează pe utilizarea a două perechi independente de primeri pentru o regiune specifică a genei: un primer în ambele perechi este comun, iar al doilea primer din fiecare pereche are o structură diferită și este complementar fie unei secvențe de ADN normală, fie mutantă. Ca rezultat al unei astfel de reacții, două tipuri de produse PCR pot fi sintetizate simultan în soluție - normală și mutantă. Mai mult, proiectarea primerilor utilizați face posibilă diferențierea clară a produselor de amplificare normale și mutante după dimensiunea lor moleculară. Această metodă este foarte vizuală și vă permite să verificați atât transportul homo- și heterozigot al alelei mutante.

Metodă pentru modificarea direcționată la situs a ADN-ului amplificat

Metoda se bazează pe utilizarea unui așa-numit primer de nepotrivire în PCR (nu este complet complementar cu șablonul), care diferă de secvența ADN șablon printr-o singură nucleotidă. Ca rezultat al includerii primerului specificat în produsul PCR mutant, în acesta se formează un situs de restricție creat artificial pentru una dintre endonucleazele de restricție, care permite diagnosticarea directă a ADN-ului unei anumite mutații cunoscute folosind analiza de restricție. Crearea unui astfel de sit de restricție artificial este necesară dacă căutarea nu a relevat existența unei enzime cunoscute și disponibile, al cărei sit de restricție „natural” este afectat ca urmare a apariției mutației studiate în molecula de ADN. .

Metoda PCR a transcriptazei inverse (RT- PCR)

Această metodă este utilizată în cazurile în care este mai convenabil să se folosească nu ADN genomic ca obiect de studiu, ci un ADNc mai compact și mai bogat în informații, obținut după procesarea corespunzătoare a probelor de țesut, de exemplu, material de biopsie sau linii celulare de limfocite, fibroblaste, etc. Condiția importantă aici este expresia (cel puțin minimă) a genei dorite în țesutul studiat.

În prima etapă, se realizează transcripția inversă a ARNm, iar moleculele de ADNc rezultate servesc ca matriță pentru PCR. Ulterior, regiunea critică a ADNc, amplificată în cantitate suficientă, este supusă secvenței și altor metode de screening al mutațiilor, studiului electroforetic direct (detecția delețiilor, inserțiilor etc.) sau integrării într-un sistem de expresie în vederea obținerii produs proteicși analiza lui directă.

Această metodă este deosebit de eficientă pentru detectarea mutațiilor care duc la sinteza unei proteine ​​„trunchiate” (mutații nonsens, mutații splicing, deleții mari) - așa-numita analiză PTT (Protein Truncation Test). Analiza PTT este utilizată în mod obișnuit în studiul genelor multiexon lungi, cum ar fi gena distrofiei musculare Duchenne/Becker, ataxia telangiectaziei sau neurofibromatoza de tip 1.

PCR în timp real(PCR în timp real, engleză)

În fiecare an, PCR în timp real devine o metodă de diagnostic din ce în ce mai populară în asistența medicală practică. Caracteristica sa fundamentală este monitorizarea și analiza cantitativă a acumulării de produși de reacție în lanț a polimerazei și înregistrarea și interpretarea automată a rezultatelor obținute. Această metodă nu necesită o etapă de electroforeză, ceea ce reduce cerințele pentru un laborator PCR. Datorită economisirii spațiului de producție, reducerii numărului de personal și a cererii de determinare cantitativă a ADN/ARN, această metodă a fost utilizată cu succes în ultimii ani în cele mai mari centre sanitar-epidemiologice, de diagnostic și de cercetare din țările dezvoltate ale lumii, înlocuind PCR în formatul actual („clasic”).

PCR în timp real folosește sonde de oligonucleotide marcate fluorescent pentru a detecta ADN-ul pe măsură ce este amplificat. PCR în timp real permite analiza completă a unei probe în 20-60 de minute și teoretic este capabilă să detecteze chiar și o moleculă de ADN sau ARN într-o probă.

Orez. 17. PCR în timp real.

PCR în timp real folosește un sistem TaqMan care controlează cinetica PCR direct în timpul amplificării folosind stingerea fluorescenței prin rezonanță. Pentru detectare, se folosește o sondă care poartă un fluorofor și un stingător complementar părții de mijloc a fragmentului amplificat. Când fluoroforul și stingerea sunt cuplate la sonda oligonucleotidă, se observă doar o emisie fluorescentă minoră. În timpul procesului de amplificare, datorită activității exonucleazei de 5" a polimerazei Taq, eticheta fluorescentă intră în soluție, eliberată de apropierea sa de stingător, și generează un semnal fluorescent care crește în timp real proporțional cu acumularea amplificatorului ( Fig. 17).

Principalele avantaje ale PCR în timp real față de PCR cu electroforeză pe gel:

· Întreaga metodă se desfășoară într-o singură eprubetă;

· Metoda durează 1 oră;

· 1-2 camere de lucru sunt suficiente;

· Alături de o evaluare calitativă a rezultatului, există posibilitatea unei evaluări cantitative (de exemplu, la prescrierea terapiei antivirale pentru SIDA sau hepatită virală, este necesar să se cunoască încărcătura virală, adică cantitatea de virus pe unitate, care este furnizată de PCR în timp real);

· Riscul de contaminare este redus drastic.

Concluzie

Metoda PCR este una dintre cele mai comune metode de cercetare biologică moleculară. Această metodă ar trebui să fie folosită în mod inteligent de către clinicieni, iar un medic care decide să folosească PCR în activitatea sa trebuie să aibă anumite cunoștințe despre caracteristicile și capacitățile acestei metode. În al doilea rând, trebuie să existe un feedback strâns între clinician și laboratorul PCR, care este necesar pentru a analiza cazurile complexe și a dezvolta strategia de diagnosticare corectă. În al treilea rând, analiza PCR nu este un panaceu în diagnostic (în primul rând boli infecțioase) și nu înlocuiește metodele de cercetare existente, ci doar le completează. Și cel mai important, PCR nu poate înlocui intuiția și gândirea analitică pe care trebuie să le aibă un medic care se așteaptă la succes.

P . S . Cercetare biologică moleculară - schimbarea ghidurilor pentru diagnostic și tratament. Utilizarea metodelor biologice moleculare este asociată cu perspectiva unei schimbări radicale a accentului în diagnosticul de laborator. Poate că nu este vorba doar despre informații oportune, ci despre primirea lor în avans. Dacă acum testele de laborator în majoritatea cazurilor sunt efectuate deja atunci când boala s-a dezvoltat și tratamentul a început, atunci informațiile de laborator de biologice moleculară sunt de așteptat să permită identificarea înclinației unei persoane către anumite tipuri de patologie și a gradului de sensibilitate la anumite medicamente. , care va justifica natura predictivă, preventivă și personalizată a viitoarei medicini.

SCHIMBAREA ORIENTĂRILOR DE DIAGNOSTIC ȘI TRATAMENT

BOLI EREDITARE

Astăzi În viitor

Diagnostic Pașaport genetic

8. De câte săli de lucru sunt necesare pentru a funcționa un laborator PCR cu detecție fluorescentă (analiza cantitativă, PCR în timp real)?

9. Ce este detectarea?

10. Ce metode de diagnosticare ADN există?

11. Lucrarea cărei enzime stă la baza PCR?

12. De ce trebuie îndepărtată zona de detectare din alte zone de lucru?

13. Ce este un site de restricții?

14. Care sunt diferențele dintre metodele de diagnostic ADN direct și indirect?

15. Ce este secvențierea?

16. Ce este PCR multiplex?

17. Ce tipuri de mutații sunt determinate folosind PCR?

18. Ce este contaminarea?

19. Care este esența metodei de amplificare specifică alelelor?

20. Condiții de depozitare a materialului PCR?

21. În ce dispozitiv are loc amplificarea?

22. Ce este metoda PCR cu revers transcriptază (RT-PCR)?

23. Ce servește ca material pentru diagnosticarea PCR?

24. Enumerați tipurile de contaminare?

Teste pentru auto-pregătire

1. Enzime de restricție a endonucleazei:

a) enzime care „rup” ADN-ul în locuri strict specifice;

b) enzimele care unesc între ele rupturi în molecula de ADN;

c) enzime care furnizează compuși care efectuează repararea ADN-ului.

2. Amplificarea genelor:

3. Ce metodă de genetică moleculară este utilizată pentru a diagnostica bolile cauzate de o genă mutantă dintr-o secvență cunoscută?

a) utilizarea unei enzime de restricție specifice;

b) detecție directă folosind sonde moleculare specifice;

c) analiza de familie a distribuției polimorfismelor de lungime a fragmentelor de restricție normale.

4. Secvențierea ADN:

a) identificarea secvenței de baze ADN;

b) repetiții multiple ale oricărei secțiuni ADN;

c) izolarea unui fragment de ADN care conţine gena studiată.

5. Pentru a obține probe de ADN puteți utiliza :

b) vilozităţi coriale;

c) lichid amniotic;

d) celulele lichidului amniotic;

e) probe de biopsie de piele, mușchi, ficat,

e) totul este corect, cu excepția punctului „c”,

g) totul este corect, cu excepția punctului „d”,

h) toate cele de mai sus sunt adevărate.

6. Pentru a diagnostica ce mutații este utilizată metoda PCR:

a) genomic;

b) cromozomiale;

c) gena (punctul).

7. Grundul este:

a) secțiune complementară a ADN-ului;

b) o secvenţă de oligonucleotidă sintetică marcată (radioactiv sau fluorescent) complementară unei gene mutante sau normale;

c) o oligonucleotidă care acționează ca un „primer” și inițiază sinteza unui lanț polinucleotidic pe o matrice ADN sau ARN.

8. Cine a dezvoltat principiul metodei PCR?

b) K. Mullis

9. Este metoda PCR utilizată pentru a diagnostica expansiunea repetărilor trinucleotidelor (un tip dinamic de mutație)?

10. În ce domenii se utilizează PCR?

a) medicina clinica;

b) determinarea organismelor transgenice (OMG)

c) identificare personală, stabilire a paternităţii, criminalistică

d) toate cele de mai sus,

e) niciuna dintre cele de mai sus..

Exemple de răspunsuri: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – în; 7 – în; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Principal

1.Genetica Bochkov. Moscova. GEOTAR, 2002.

Adiţional

1. , Bakharev și tratamentul bolilor congenitale și ereditare la copii. – Moscova, 2004.

2. Diagnosticare ADN și consiliere genetică medicală. – Moscova, 2004.

3. Genetica Ginter. – Moscova, 2003.

4. Fundamentele Gorbunov ale geneticii medicale. – Sankt Petersburg: Intermedica, 1999.

5. Herrington S., J. McGee. Diagnosticul clinic molecular. – Lumea, 1999.

6. Menshikov - cercetare biologică în diagnosticul clinic de laborator: posibilitățile problemei (prelegeri). Diagnosticare clinică de laborator, nr. 3, 2006.

7. Munca lui Kornienko în laboratorul PCR în timpul analizei în linie a materialului biologic. Diagnosticare clinică de laborator, nr. 10, 2006.

8. Organizarea lucrului de laborator PCR. Instrucțiuni metodice. MU 1.3.1794-03. Medicul șef sanitar al Federației Ruse, 2003.

9. Tehnologia Erlich H. A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time cantitative PCR. Genom Res. – nr. 6, 1996.

PRINCIPIILE DE BAZĂ ALE METODEI

REACȚIA LANȚULUI POLIMERAZEI

Manual metodologic de lucru extracurricular al elevilor de 3-4 ani la specialitățile de medicină generală (060101) și pediatrie (060103).

GOU VPO „Academia Medicală de Stat Krasnoyarsk a Agenției Federale pentru Sănătate și Dezvoltare Socială”

Rusia, Krasnoyarsk,

Reacția în lanț a polimerazei (PCR pe scurt) este o metodă de diagnostic modernă și ultra-precisă la nivel genetic și molecular. Diagnosticarea PCR face posibilă determinarea dacă o persoană are o infecție sau o boală ereditară.

Esența metodei este că ADN-ul sau ARN-ul materialului luat pentru cercetare suferă multiplicare (amplificare) multiplă, ceea ce este posibil în prezența enzimelor. Datorită acestui fapt, se obține o masă mare de ADN sau ARN, din care se face o evaluare vizuală. Specialiștii au o bază de date cu informații despre structura tuturor agenților patogeni și, în conformitate cu aceasta, evaluează ce microorganism au primit.

Materialul testat (salivă, sânge, spută etc.) este plasat în interiorul unui dispozitiv special (amplificator) și se adaugă anumite enzime. Ele se combină cu ADN-ul sau ARN-ul studiat și provoacă sinteza copiilor lor. Folosind PCR, este posibil să se determine tipul de agent patogen și cantitatea acestuia.

Interesant! Metoda PCR a fost inventată în 1983 de omul de știință american Carrie Mullis. Pentru această descoperire a fost distins cu Premiul Nobel pentru Chimie.

Eprubete cu material de testat

Argumente pro şi contra

Tehnica PCR a fost folosită recent în medicină și a ocupat un loc important în procesul de diagnosticare.

Avantajele metodei:

1. Identificarea directă a agentului patogen. Unele metode, de exemplu, imunotestul enzimatic, fac posibilă detectarea proteinelor secretate de microbi. Aceasta este o determinare indirectă a prezenței agenților patogeni. Și prin PCR, o bucată de ADN aparținând unei anumite infecții este detectată cu mare precizie.
2. Specificitatea tehnicii. Deoarece PCR detectează ADN aparținând agentului patogen, este aproape imposibil să se obțină o concluzie falsă (cu excepția unui agent patogen necunoscut). Și cu metoda imunologică, poate apărea o eroare din cauza unei reacții încrucișate între antigeni.
3. Sensibilitate mai mare. Metoda determină prezența chiar și a unor cantități foarte mici de bacterii sau viruși în organism. 10 celule patogene per probă sunt suficiente. Pentru alte metode, numărul minim de celule trebuie să fie de cel puțin 105.
4. Versatilitatea tehnicii. Procesul de cercetare pentru diferite microorganisme este similar datorită asemănării întregului ADN și ARN. Pe baza acestui lucru, este posibil să se identifice mai mulți agenți patogeni într-o singură probă.
5. Obțineți o concluzie rapidă. Din momentul în care se prelevează proba și până la obținerea rezultatului, nu trec mai mult de 4-5 ore. PCR nu necesită însămânțarea culturii, așa că metoda este destul de rapidă.
6. Eficiența diagnosticului pentru tipurile latente de infecții. Metoda identifică acele microorganisme care sunt greu sau imposibil de cultivat. Astfel de agenți patogeni se găsesc în formele latente ale bolii.
7. Domeniu larg de utilizare. PCR poate fi folosită nu numai pentru a diagnostica bolile umane, ci și pentru a determina microorganismele din sol, produse, apă etc.

Dar puteți întâlni dezavantaje ale metodei PCR:

1. Microbii sunt capabili de schimbare. Agenții patogeni se pot schimba și muta. Prin urmare, este posibil să nu fie detectabile prin PCR.
2. Capacitatea de a multiplica ADN-ul nu numai al unui agent patogen viu, ci și al unui mort. Pentru a evita această situație, PCR poate fi utilizat doar la 1-2 luni după recuperarea de la o boală anterioară.

Tipuri de PCR

Metoda de cercetare este utilizată în diverse scopuri, prin urmare tehnica PCR are varietăți:

1. Cu transcripție inversă - utilizat pentru dublarea repetată și determinarea ulterioară a cărui microorganism a fost izolat ARN. Pentru a face acest lucru, utilizați o bibliotecă de date despre structurile diferiților agenți patogeni.
2. Inversat – folosit atunci când există o secțiune mică într-o anumită secvență.
3. Imbricat - folosit pentru a reduce cantitatea de produse de reacție nedorite. În aceste scopuri, sunt efectuate două studii secvenţiale.
4. Asimetric - folosit dacă trebuie să multiplicați într-o măsură mai mare unul dintre toate lanțurile de ADN disponibile.
5. Cantitativ (în timp real) - necesar pentru studierea directă a modului în care cantitatea de produs obținută se modifică în fiecare nou ciclu al reacției PCR.
6. Digitalul este cel mai modern și mai precis.
7. Specific de grup este un studiu care este realizat pentru a studia legăturile de familie.
8. Stepped – reduce influența interacțiunilor primerului nespecific.

Umplerea tuburilor cu probe de sânge

Decodificarea rezultatelor

La încheierea studiului, se oferă un răspuns clar despre prezența unui agent patogen, care poate fi:

• negativ, aceasta înseamnă că nu există infecție;
• pozitiv - există.

Detectarea infecției poate apărea chiar și în absența simptomelor bolii la o persoană. Acest stadiu inițial infecţie. Uneori puteți obține un răspuns fals pozitiv (în pragul unui rezultat negativ și pozitiv). În acest caz, analiza trebuie repetată. O atenție deosebită trebuie acordată asigurării faptului că materialul este colectat în deplină conformitate cu toate cerințele.

Timp de pregătire pentru analiza PCR

În practică, rezultatul studiului poate fi obținut în 2 zile. Uneori se poate face mai repede - în ziua livrării.

Pret pentru procedura

Costul PCR este determinat de ce infecție va fi testată. Depinde și de metodologia de testare utilizată. Prețul mediu al analizei variază de la 200 la 850 de ruble. Prețul include și o taxă pentru colectarea materialului - aproximativ 400 de ruble.

Prețuri aproximative pentru testarea PCR.

Adesea, instituțiile medicale oferă testarea mai multor infecții simultan pentru a o identifica pe cea corectă. O astfel de examinare va costa mai mult, dar va elimina necesitatea unor studii suplimentare, ceea ce va economisi timpul pacientului.

Videoclipul „Reacția în lanț a polimerazei”

Videoclipul descrie esența metodei PCR și avantajele acesteia. Filmat de canalul SiberianMedicalLaboratory.

Analiza PCR - ce este? Acest metoda eficienta biologie moleculară, care este utilizat în combinație cu studii imunologice, morfologice și biochimice tradiționale. Bolile infecțioase evoluează și se dezvoltă, la fel ca omenirea însăși. În fiecare an sunt din ce în ce mai multe dintre ele și devin din ce în ce mai greu de diagnosticat. Factorii care provoacă apariția bolilor și influențează dezvoltarea acestora, de asemenea, se adaptează treptat la condițiile externe din jur, schimbându-se odată cu acestea. Acesta a fost motivul pentru care în medicină au început să apară noi metode și tehnologii care ajută la obținerea unor rezultate mai precise în diagnosticul unei anumite boli.

Această metodă de diagnostic de laborator al bolilor infecțioase se bazează pe detectarea agentului cauzal al unei infecții pe care medicul o suspectează în materialul de cercetare. Reacția în lanț a polimerazei le va identifica prin identificarea materialului genetic corespunzător (ARN sau ADN) în probele prelevate de la pacient.

PCR a fost inventat de omul de știință american Kary Mullis în 1983.

Majoritatea infecțiilor, dacă sunt detectate devreme, sunt foarte tratabile. Acesta este motivul pentru care metoda PCR este atât de eficientă, deoarece poate chiar detecta viruși sau bacterii ale căror celule sunt izolate în material. Mai mult, un astfel de diagnostic identifică virusul, stabilește natura aspectului său, forța cu care afectează organismul, chiar și numărul de microbi din corpul pacientului.

Medicul va putea folosi toate informațiile obținute prin metoda reacției în lanț a polimerazei pentru a selecta medicamentele adecvate și pentru a prescrie tratamentul adecvat.

Cercetare PCR

Conform însuși principiului de funcționare, totul se întâmplă destul de simplu. Materialul biologic prelevat de la pacient este plasat într-un reactor special. Apoi se adaugă acolo enzime specifice care pot intra în contact cu ADN-ul microbului existent în material și pot sintetiza copia acestuia.

Copierea se bazează pe principiul unei reacții în lanț. Adică, întregul proces va necesita mai multe etape. Mai întâi, 1 moleculă de ADN formează 2 molecule noi, apoi se fac din ele 4 noi și așa mai departe până la sute și mii de copii. După aceasta, se va efectua analiza și decodificarea.

• Fragmentele de ADN microbian pot fi conținute în diferite materiale biologice:
• în lichide biologice (salivă, lichid articular, lichid amniotic, lichid pleural, lichid cefalorahidian, suc de prostată);
• în răzuirea celulelor epiteliale (răzuire din canalul cervical, din uretră - atât pentru femei, cât și pentru bărbați);
• în urină (urina de dimineață, și anume prima sa porțiune, va fi necesară pentru analiză);
• în spută;
• în mucus și alte secreții biologice;
• în biopatiile stomacului şi duodenului.

Ce boli pot fi detectate prin PCR?

Medicii consideră că acest tip de diagnostic este unul dintre cele mai precise. Acest studiu ne permite să detectăm aproape toate bolile virale cunoscute în prezent de medicină. Un aspect foarte important este că printre ele există infecții care trăiesc în corpul uman de multi ani

, fără să se arate în vreun fel. Pur și simplu cresc în așteptarea când va fi cel mai confortabil pentru ei să se manifeste (imunitate scăzută, epuizare a organismului etc.). Detectarea unor astfel de infecții latente este deosebit de importantă în zonele urologice și ginecologice.

• Iată câteva boli pentru care se efectuează adesea analiza reacției în lanț a polimerazei:
• hepatita B și C;
• multe boli cu transmitere sexuală (diagnostic de chlamydia, ureaplasmoză, micoplasmoză, candidoză genitală, vaginoză bacteriană, trichomoniază, mononucleoză infecțioasă, infecție cu papilomavirus (HPV), SIDA etc.);
• infecție cu herpes (inclusiv herpes genital);

tuberculoza si helicobacterioza. Metoda PCR dă rezultate bune

, deoarece majoritatea acestor boli se caracterizează prin faptul că simptomele lor (mai ales într-un stadiu incipient) nu sunt deosebit de vizibile. Dar consecințele pe care le au asupra organismului sunt foarte negative și adesea foarte periculoase pentru sănătate și chiar pentru viață.

O astfel de analiză este, de asemenea, foarte relevantă pentru detectarea în timp util a hepatitei virale, tuberculozei și diferitelor infecții intestinale. Când este necesar un tratament imediat, este foarte important să înțelegem exact ce agent patogen a afectat organismul și cu ce trebuie tratat. Sângele pacientului sau orice alt material biologic va ajuta la efectuarea unui diagnostic complet și corect și la prescrierea unui tratament care va ajuta la restabilirea rapidă a funcțiilor corpului și la promovarea recuperării.

Herpesul este, de asemenea, extrem de persistent și periculos. Dintr-un mod inactiv, se poate transforma cu ușurință într-unul progresiv, afectând sistemul nervos central, influențând apariția și dezvoltarea unor astfel de boli teribile precum meningita și encefalita.

transcrierea analizei

După efectuarea studiului, puteți primi fie un rezultat pozitiv, fie un rezultat negativ. Rezultatele pozitive vor indica faptul că o anumită infecție este prezentă în corpul dumneavoastră. Un rezultat negativ înseamnă că nu există nicio infecție suspectată în corpul pacientului. Adică nu s-a găsit nimic în materialul biologic care a fost supus cercetării.

Orice indicator trebuie să fie descifrat și anunțat de un medic. Nu vă supărați sau nu vă temeți de rezultate proaste, deoarece reacția a dezvăluit boala, ceea ce înseamnă că, după examinări suplimentare, medicul va putea prescrie un tratament complet. Principalul lucru este să nu se automediceze și să nu întârzie procesul.

Pregătirea pentru analiză: ce trebuie să știți?

Detectarea diferitelor boli va necesita materiale biologice diferite. Înainte de a face PCR, asigurați-vă că vă consultați cu un specialist adecvat și vă pregătiți cu atenție pentru procedura următoare.

Pentru a face acest lucru, va trebui să urmați cu strictețe toate recomandările și instrucțiunile medicului dumneavoastră. Amintiți-vă că sângele este de obicei extras pe stomacul gol. Pentru a lua un frotiu din vagin sau uretră, trebuie să vă abțineți de la actul sexual timp de 1-2 zile, să efectuați toată igiena genitală necesară seara și să clătiți doar cu apă caldă dimineața. De asemenea, este important să încetați să îl luați cu aproximativ o săptămână înainte medicamente dacă nu este discutat cu medicul dumneavoastră. Și timp de 2-3 ore înainte de a face testul, nu urinați. Pentru femei, merită luat în considerare faptul că momentul optim pentru efectuarea studiului este cu câteva zile înainte sau imediat după menstruație.

Metoda PCR: principalele avantaje și dezavantaje

Acest tip de diagnostic are multe avantaje.

În primul rând, orice agenți patogeni ai bolilor infecțioase sunt determinați prin indicarea directă a acestora, spre deosebire de alte teste tradiționale de laborator.

În al doilea rând, această analiză este pur și simplu universală, deoarece aproape orice materiale biologice sunt disponibile pentru implementarea ei, care adesea nu sunt acceptabile pentru nicio altă metodă de cercetare.

Un punct foarte important este că atunci când se realizează acest diagnostic, în materialul studiat este izolat un fragment de ADN, care va fi caracteristic doar unui anumit agent patogen, adică un virus sau bacterii deosebit de specifice. Aceasta indică cât de specifică este această reacție.

Un alt argument în favoarea acestui diagnostic va fi viteza mare de executare a acestuia. Dacă studiile culturale necesită nu zile, ci chiar săptămâni necesare pentru izolarea și creșterea agentului patogen în cultura celulară, atunci această metodă vă va permite să obțineți rezultate în 4-5 ore.

PCR face posibilă detectarea nu numai a unei infecții care este deja la vârful bolii, ci și a bolilor cronice, a oricăror virusuri sau bacterii individuale. Acest diagnostic este posibil datorită sensibilității foarte mari a metodei. Aceasta ar trebui să includă, de asemenea, faptul că infecția va fi detectată chiar dacă doar o celulă a unui anumit virus sau bacterie este prezentă în materialul biologic care a fost supus analizei.

Reacțiile la rezultate fals negative sunt foarte rare.

Adevărat, metoda are și dezavantajele ei. Una dintre ele este posibilitatea de a obține un rezultat fals pozitiv. Acest lucru se întâmplă adesea pentru că infecția a fost deja ucisă, dar celulele sale epiteliale nu au fost încă reînnoite, așa că reacția va vedea în continuare rămășițele sale moarte și o va clona. Prin urmare, ar trebui fie să așteptați până când celulele moarte ale infecției sunt complet îndepărtate din organism (de la o lună la două după tratament), fie să utilizați alte metode într-un stadiu incipient: însămânțare sau cultură. Ulterior va fi posibil să se efectueze controlul folosind PCR.

Un alt punct slab al analizei este variabilitatea tuturor microorganismelor. Aceasta înseamnă că unele genotipuri de agenți patogeni care au suferit deja mutații în organism vor fi evazive pentru sistemul de testare și nu va avea loc nicio reacție. În acest scop, se fac diverse dezvoltări pentru a îmbunătăți această metodă.